Лаборатории микробиологии проводят исследования в области бактериологии, вирусологии и иммунологии в зависимости от профиля. Лаборатория должна быть оснащена соответствующим оборудованием и оборудованием в соответствии со своим назначением.
Лаборатория должна располагаться в отдельном здании или изолированной его части с водоснабжением, канализацией, отоплением и горячим водоснабжением и отдельным входом.
Для лаборатории общей микробиологии необходимы следующие помещения:
Для работы в лаборатории необходимо носить халат, чтобы защитить одежду и кожу от контакта с реагентами, коррозии и загрязнения микроорганизмами.
Каждый должен работать на закрепленном за ним рабочем месте.
Перемещение в другие места без разрешения инструктора не допускается. Рабочее место должно содержаться в чистоте и не загромождено посудой и другими предметами.
Студентам запрещается работать в лаборатории в неустановленное время без присутствия преподавателя или научного сотрудника или без разрешения преподавателя.
Вы можете начать только после получения инструкций по технике безопасности и разрешения учителя перед выполнением каждого экспериментального задания.
Приступая к работе, вам необходимо:
При проведении экспериментов используйте только чистую и сухую лабораторную посуду. Для измерения
Для каждого реагента требуется мерный контейнер (пипетка, бюретка, стакан, градуированный цилиндр или мерный стакан). Во избежание порчи реагентов не переливайте излишки реагента из пробирки обратно в контейнер.
Опыты необходимо проводить в строгом соответствии с описанием методических указаний, особенно порядка добавления реагентов.
Если в ходе эксперимента требуется нагрев реакционной смеси, необходимо следовать приведенным методическим указаниям для таких способов нагрева, как водяная баня, электроплита или газовая горелка. Нагревание легколетучих легковоспламеняющихся материалов на открытом воздухе опасно огонь.
Лабораторная работа по диагностике инфекционных заболеваний сопряжена с риском заражения персонала и микробного заражения окружающей среды патогенными биологическими агентами (ПБА).
В состав ПБА входят различные группы микроорганизмов, такие как бактерии, вирусы, микроскопические грибы и гельминты, а также любые материалы, в которых они могут присутствовать. В Российской Федерации принята классификация ПБА на четыре группы по степени опасности для человека:
По указанным выше причинам микробиологические лаборатории, работающие с биологически активными биологическими агентами, располагаются в зданиях или помещениях с отдельными входами.
Помещения лаборатории разделены на «грязную» и «чистую» зоны, причем в первой зоне возбудители используются, а во второй нет. Между «чистой» и «грязной» зонами находится санпропускник.
В «чистую зону» входят:
К «грязным» зонам относятся:
Все окна и двери во всех комнатах должны быть плотно закрыты. Приточные и вытяжные отверстия в «грязной» зоне оснащены фильтрами для тщательной очистки вытяжного воздуха.
Рабочие помещения, работающие с живыми патогенами, должны быть оборудованы бактерицидными лампами.
В автоклаве, столах и стеллажах обязательна маркировка чистых и зараженных материалов.
Лабораторная мебель, поверхности пола, покрытия стен и потолка должны быть гладкими и устойчивыми к воздействию моющих и дезинфицирующих средств.
Согласно технике безопасности при использовании ПБА соблюдаются следующие требования:
Каждая лаборатория независимо от ее принадлежности имеет право осуществлять деятельность только при наличии санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с патогенными биологическими агентами (дается срок действия 5 лет).
Сотрудничество с ПБА III-IV групп разрешается главным государственным врачом субъектов Российской Федерации I-II групп. Сотрудники лаборатории должны иметь высшее или среднее специальное образование и проходить ежегодное обучение технике безопасности при обращении с биологически активными биологическими материалами.
В университетских аудиториях микробиологии студенты должны соблюдать следующие минимальные требования безопасности:
Лаборатория должна иметь следующее оборудование:
Помимо перечисленного оборудования, в лаборатории потребуются:
Для изучения морфологии и строения микроорганизмов применяют микроскопы, обеспечивающие увеличение в сотни раз (оптические) или тысячи раз (электронные). Бактериологическая лаборатория оснащена микроскопами различных типов: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам».
К механической части микроскопа относится штатив, состоящий из основания. И держатель для трубки. Трубодержатель снабжен столиком с тубусом, револьвером, представляющим собой вращающийся диск с гнездом для линзы, и зажимом, фиксирующим предметное стекло на объекте исследования.
Трубку перемещают вверх и вниз с помощью макро- и микрометрических винтов.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветителя, зеркала, диафрагмы, конденсора, объектива и окуляра. Под конденсором подвижно закреплено зеркало, одна из его поверхностей плоская, другая — вогнутая.
Если вы используете конденсор, используйте плоскую поверхность без конденсора и вогнутую сторону зеркала. Для концентрации световых лучей, отраженных зеркалом, используется конденсор, фокус которого должен находиться в плоскости препарата.
Верхняя линза конденсора плоско-выпуклая, нижняя — двояковыпуклая. Под конденсором расположена апертурная (ирисовая) диафрагма. Освещенность поля зрения регулируется путем изменения диаметра апертурного отверстия, через которое проходит световой луч.
Объектив состоит из нескольких линз, заключенных в металлическую оправу. Только одна линза (передняя) выполняет функцию увеличения, остальные предназначены для коррекции изображения. Под рабочим расстоянием объектива понимается расстояние от плоскости передней линзы до объекта исследования в фокусе.
Чем выше увеличение объектива, тем уже рабочее расстояние и поле зрения. На корпусе объектива указана кратность увеличения (8х, 20х, 40х, 90х) и числовая апертура, указывающая количество света, попадающего в объектив. Окуляр содержит окуляр и собирающую линзу, увеличивающую изображение, получаемое линзой.
Увеличение указано на окуляре (х5, х7, х10, х15). Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений окуляра и линзы. Например, окуляр с 10-кратным увеличением и объектив с 90-кратным увеличением увеличат объект в 900 раз.
Важно получить не только увеличенное изображение объекта исследования, но и четкое изображение. Резкость изображения зависит от разрешения микроскопа. Под разрешением понимается минимальное расстояние, на котором две точки можно увидеть по отдельности.
Разрешение микроскопа можно увеличить, используя более короткие световые лучи или приближая показатель преломления среды, прилегающей к линзе, к показателю преломления стекла.
Для этого воздушное пространство между линзой объектива и предметным стеклом заменяют специальной жидкостью с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. Это особенно необходимо при использовании объективов с большим увеличением (90x и выше) с небольшой площадью передней линзы.
Показатели преломления стекла и воздуха равны 1,52 и 1,0 соответственно. Поэтому в качестве иммерсионных жидкостей для создания оптически однородной среды между предметным стеклом и объективом чаще всего используют кедровое масло (n = 1,5), глицерин (n = 1,4) и воду (n = 1,3).
Объективы с масляной иммерсией называются «МИ», а линзы с водной иммерсией — «VI».
Последовательность операций при микроскопическом исследовании объекта следующая:
Для исследования живых неокрашенных микроорганизмов под микроскопом используются специальные оптические системы, такие как устройства фазового контраста или темнопольные конденсоры.
К фазово-контрастным устройствам относятся:
Когда световая волна проходит через живую клетку, она задерживается по фазе примерно на четверть длины волны, а затем смещается еще на четверть после прохождения через фазовую пластинку.
После прохождения фазовой пластинки лучи совмещаются и суммируются с прямым лучом, проходящим через объект, либо они находятся в противофазе. В первом случае исследуемый объект кажется ярким на темном фоне, во втором – темным на светлом фоне.
В микробиологии широко используются фазово-контрастные приборы КФ4, при их использовании объекты кажутся темными на светлом фоне.
Последовательность перехода к использованию фазоконтрастных приборов:
В темнопольной микроскопии используется специальный конденсор с затемненной центральной частью, так что в интересующую плоскость попадают только боковые лучи, отраженные от внутренней зеркальной поверхности конденсора.
Поле зрения кажется темным, поскольку луч света направлен под углом, не попадающим на линзу объектива. Некоторые лучи, попадающие на объект, отражаются
Линза позволяет увидеть яркое изображение объекта на темном фоне.
Чтобы переключиться на темнопольную микроскопию, выполните следующие действия:
НИИ микробиологии оснащен флуоресцентными микроскопами отечественного и зарубежного производства. Атомы некоторых веществ, называемых флуоресцентными красителями, поглощают энергию и переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждение).
Возбужденное состояние слабое и стабильное, атом возвращается на стабильный низкий энергетический уровень и выделяет избыточную энергию в виде свечения. Свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждения, поэтому, когда объект облучается невидимым ультрафиолетовым светом или коротким сине-фиолетовым светом, объект светится длинноволновым светом, который хорошо виден невооруженным глазом.
В микробиологии исследуемые препараты обрабатывают флуоресцентными красителями (изотиоцианат флуоресцеина, родамин лиссамин и др.), придающими исследуемому объекту сильную люминесцентную способность. В люминесцентном микроскопе источником возбуждения люминесценции является ртутно-кварцевая лампа.
Для проведения люминесцентной микроскопии по лучу света ртутно-кварцевой лампы применяют специальные фильтры, выделяющие коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра и возбуждающие ее лучи свечением исследуемого объекта.
Длина обрезана, потому что испускающие лучи блокируются (иначе все поле зрения сильно светилось бы). Для этого между источником света и исследуемым объектом помещают светофильтр типа УФС-3, ФС-1 или СС-4, называемый светофильтром «возбуждения».
При этом длинноволновая яркость (излучение) светового потока от наблюдаемого объекта передается на окуляр, одновременно защищая глаза наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. Для этого между объектом и глазом наблюдателя размещают окулярные (запирающие) светофильтры типов ЖС-3, ЖС-18, Т1Н и Т-2Н.
Совместное использование фильтров возбуждения и отсечки в оптической системе флуоресцентного микроскопа называется принципом скрещенных фильтров. Оптимально подобранный фильтр обеспечивает четкое свечение объекта на темном фоне в поле зрения лучи из
Лампа падает на светоделительную пластину между линзой и окуляром. Нежелательный длинноволновый свет проходит через светоделитель и исчезает внутри корпуса микроскопа.
Пластина отражает возбуждающий коротковолновый свет на исследуемый объект. Часть луча возбуждения преобразуется объектом в длинноволновый луч излучения, который перед попаданием в глаз наблюдателя проходит через линзу, светоделительную пластину и блокирующий фильтр.
Другая часть луча возбуждения остается неизменной и отражается светоделителем в сторону источника света – лампы. Это дифференцирующее свойство светоделительной пластины обусловлено тем, что светоделительная пластина покрыта множеством диэлектрических слоев и расположена под углом 45° к падающему лучу.
В флуоресцентной микроскопии в качестве иммерсионных жидкостей используют специальные нефлуоресцентные масла (обычные иммерсионные масла для этой цели не подходят, так как сами излучают свет).
Длины волн в видимой области спектра составляют от 0,4 до 0,7 мкм. Следовательно, максимальное разрешение (полуволны), которое можно получить с помощью оптического микроскопа, составляет примерно 0,2 мкм (200 нм).
Волновые свойства также уникальны для электронов. При напряжениях от 50 000 до 100 000 вольт длина волны электронов составляет от 0,0055 до 0,0039 нм. По чисто техническим причинам невозможно получить теоретическое максимальное разрешение 0,002 нм, а на практике оно никогда не превышает 1-2 нм.
К основным частям электронного микроскопа относятся набор магнитных линз, люминесцентный экран и фотопластинка. Ток проходит через вольфрамовую нить, вызывая эмиссию электронов.
К нити прикладывается высокое отрицательное напряжение, создавая большую разность потенциалов между нитью накала и заземленной анодной пластиной. В этом поле электроны движутся к аноду, часть из которых проходит через отверстие в центре (центральное отверстие) анода, образуя пучок электронов, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсатором) и попадает на объект освещения.
Большинство электронов проходят через объект, не отклоняясь, но некоторые электроны выбрасываются из обычного электронного луча после столкновения с тяжелыми атомами. В результате формируется структура электронных лучей, которая в дальнейшем фокусируется для получения изображения объекта.
Электроны, проходящие через объект, фокусируются магнитной линзой объектива, создавая увеличенное изображение. Третья магнитная линза (проекция) также увеличивает изображение, которое в конечном итоге отображается на экране.
Когда флуоресцентная пластинка удалена, луч света попадает на фотопластину. Электронные микроскопы, создающие изображения при прохождении электронов через образец тонкой пленки, называются трансмиссионными или трансмиссионными микроскопами.
В сканирующем электронном микроскопе первичный электронный луч падает на поверхность объекта, закрепленного, высушенного и покрытого тонким слоем металла, создавая различные вторичные излучения.
Его прочность зависит от свойств рельефа, его проводимости и химического состава. С помощью сканирующего электронного микроскопа получают трехмерные изображения объектов. Полезное увеличение для сканирующей электронной микроскопии обычно не превышает 50 000 раз. 18:01
Клетки каждого вида бактерий имеют достаточно устойчивую форму, которую необходимо определить при идентификации микроорганизма (установлении его вида). В зависимости от формы бактерии подразделяются на следующие основные морфологические группы.
Кокки (лат cocci — зерна) — шаровидные бактерии, имеющие правильную шаровидную, овальную или бобовидную форму. В зависимости от взаимного расположения клеток их дифференцируют следующим образом:
Клетки этой группы бактерий имеют цилиндрическую форму, среди которых выделяют следующие морфологические варианты:
Палочковидные бактерии, которые при неблагоприятных условиях образуют специфическую форму существования, а именно споры, диаметр которых не превышает диаметра клетки, называются бациллами.
Если диаметр споры внутри клетки значительно превышает ее боковой диаметр, такое спорообразование является
Бактерия называется Clostridium.
Сложная (спиралевидная) бактерия. К ним относятся:
Бактерии, не имеющие постоянной формы. Микоплазмы не имеют клеточных стенок, поэтому легко меняют форму. Хотя есть исключения, большинство бактериальных клеток не дифференцируются на передний и задний или нижний и верхний концы, а значит, функционально эквивалентны.
Многие виды бактерий обладают способностью формировать морфологии на разных стадиях роста,
Отличается от типичного. Это явление называется бактериальным полиморфизмом.
Бактерии сильно различаются по размеру от 0,2 микрона (микоплазма) до 125 микрон. Размер большинства болезнетворных бактерий колеблется от нескольких десятых микрометра до нескольких микрометров. При характеристике размеров бактерий длину и ширину клеток обычно выражают в микрометрах (10–3 мм).
В качестве измерительных инструментов используются окуляр и объектив-микрометр. Окуляр-микрометр представляет собой стеклянную пластинку (помещенную внутри окуляра), имеющую линию шириной 5 мм, разделенную на 10 или 20 частей.
Объектом микрометра является предметное стекло с линией длиной 0,5 или 1,0 мм, разделенной на сотые доли. Размер клеток микроорганизма можно определить следующим образом. Поместите микрометр объектива на предметный столик и посмотрите в окуляр, чтобы совместить первую линию микрометра объектива и микрометра окуляра.
Определите цену конкретного окуляра и объектива в отделе окуляров и микрометров. Например, предметный микрометр имеет шкалу 1 мм, где одно деление равно 10-2 мм, или 10 микрон.
При объединении шкалы микрометра объектива 3 деления (30 мкм) соответствуют 14 делениям микрометра-окуляра, поэтому одно деление микрометра-окуляра составляет 30:14 = 2,14 мкм.
После определения цены одного деления окуляр-микрометра вместо предметного микрометра на столик помещают препарат с исследуемым объектом и определяют его размеры.
Например, палочковидный микроорганизм занимает 3 деления в длину и 0,5 деления в ширину окуляр-микрометра. Если одно деление окуляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки равна 3 х 2 = 6 мкм, а ширина 0,5 х 2 = 1 мкм.